Regulation of intrinsic excitability by Kv2.1 and its role in encephalopathic epilepsies
Régulation de l’excitabilité intrinsèque par Kv2.1 et son implication dans les encéphalopathies épileptiques
Résumé
Kv2 channels, which underlie ≈ 80% of delayed-rectifier K+ current, are required for efficient cell repolarization during high-frequency action potential firing. However, it has also been suggested that these channels have a role related to their ability to create clusters on the surface of neurons, at the soma, proximal dendrites and the initial segment of the axon. Indeed, some clusters co-localize with areas of contact between the plasma membrane and the endoplasmic reticulum, and it has been proposed that Kv2.1 could organize these contacts and modulate calcium signalling independently of its role as a potassium channel. Furthermore, one study showed that Kv2.1 channels present in clusters have a very reduced conductance. The state of phosphorylation, regulated by neuronal activity, has a considerable impact on their voltage dependence and ability to form clusters. Mutations in Kcnb1, the gene coding for Kv2.1, have recently been associated with epileptic en-cephalopathies, combining seizures with motor and cognitive disorders. Interestingly, several functionally uncharacterized mutations target the C-ter end of the Kv2.1 subunit, resulting in trun-cated proteins lacking the “Proximal Restriction and Clustering” (PRC) domain responsible for cluster formation. Patients with these mutations do not always have epileptic disorders, but pre-sent cognitive delays and autistic disorders. During my thesis, I set out to characterize two mutations impacting the PRC domain, with the hy-pothesis that their inability to form clusters would have a functional consequence on neuronal ex-citability. First, I described changes in the distribution of Kv2.1 channels Y533* and R583*, using confocal microscopy and PALM/STORM super-resolution experiments, by transfecting them into cultured pyramidal neurons. Channels carrying mutated subunits are redistributed towards distal dendrites, forming small clusters. Analysis of their lateral diffusion by tracking single particles led me to the hypothesis that mutated subunits form mixed channels with endogenous non-mutated channels, which would explain their residual cluster formation. From a functional point of view, with patch-clamp experiments I have shown that neurons expressing mutated subunits have re-duced excitability compared with those expressing wild-type channels. The literature suggests a role for Kv2 in the active properties and calcium transients of dendrites. I therefore adapted a bio-physical model of the pyramidal hippocampal neuron (CA1) to analyse this possibility, taking into account differences in the distribution of wild-type and mutated channels, as well as variations in voltage dependence. The model predicts a significant effect in the case of prolonged synaptic ac-tivation. My calcium imaging experiments confirm this prediction, as stimulation of neurons with Kv2 blockade results in an increase in dendritic calcium transients, revealing a likely action on ac-tion potential back-propagation. In conclusion, my results strongly suggest that the regulation of Kv2.1 cluster formation is involved in the control of neuronal excitability, and that altering their conductance in dendrites could modify synaptic integration and plasticity.
Les canaux Kv2, qui sous-tendent ≈ 80% du courant K+ à rectification retardée, sont nécessaires pour une repolarisation efficace de la cellule lors de décharges de potentiels d’action à forte fréquence. Cependant, il a été aussi suggéré que ces canaux aient un rôle lié à leur capacité de créer des clusters à la surface de neurones, au niveau du soma, des dendrites proximales et du segment initial de l’axone. En effet, certains clusters co-localisent avec des zones de contact entre la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique et il a été proposé que Kv2.1 pourrait organiser ces contacts et moduler la signalisation calcique indépendamment de son rôle de canal potassique. De plus, une étude a montré que les canaux Kv2.1 présents dans les clusters ont une conductance très réduite. L’état de phosphorylation, régulée par l’activité neuronale, impacte de manière considérable leur dépendance au voltage et leur capacité à former des clusters. Les mutations de Kcnb1, le gène codant pour Kv2.1, ont été récemment associées à des encéphalopathies épileptiques, combinant crises épileptiques avec troubles moteurs et cognitifs. De manière intéressante, plusieurs mutations non caractérisées du point de vue fonctionnel, ciblent l’extrémité C-ter de la sous-unité Kv2.1, donnant des protéines tronquées dépourvues du domaine « Proximal Restriction and Clustering » (PRC) responsable de la formation de clusters. Les patients portant ces mutations n’ont pas toujours de troubles épileptiques mais présentent des retards cognitifs et troubles autistiques. Au cours de ma thèse j’ai donc cherché à caractériser deux mutations impactant le domaine PRC ayant comme hypothèse que leur incapacité à former de clusters aurait une conséquence fonctionnelle sur l’excitabilité neuronale. Dans un premier temps, j’ai décrit les modifications de la distribution des canaux Kv2.1 Y533* et R583*, par des expériences de microscopie confocale et de super-résolution PALM/STORM en les transfectant dans des neurones pyramidaux en culture. Les canaux portant les sous-unités mutées se retrouvent redistribués vers les dendrites distales et ils forment de clusters de petite taille. L’analyse de leur diffusion latérale par suivie de particules uniques m’a permis d’avancer l’hypothèse que les sous-unités mutées forment de canaux mixtes avec les canaux endogènes non mutés, ce qui expliquerait leur formation résiduelle de clusters. Du point de vue fonctionnel, avec des expériences de patch-clamp j’ai montré que les neurones exprimant les sous-unités mutées ont une excitabilité réduite par rapport aux ceux expriment les canaux sauvages. La littérature propose un rôle du Kv2 dans les propriétés actives ainsi que dans les transients calciques des dendrites. J’ai donc adapté un modèle biophysique de neurone pyramidal d’hippocampe (CA1) pour analyser cette possibilité en prenant compte de différences de distribution de canaux sauvages et mutés, ainsi que les variations de dépendance au voltage. Le modèle prédit un effet important dans le cas d’une activation synaptique prolongée. Mes expériences d’imagerie calcique confirment cette prédiction, car la stimulation des neurones en bloquant le Kv2 entraine une augmentation des transients calcique dendritiques révélant une action probable sur la rétropropagation de potentiels d’action. En conclusion, mes résultats suggèrent fortement que la régulation de la formation de clusters de Kv2.1 participe au contrôle de l’excitabilité neuronale et que la modification de leur conductance dans les dendrites pourrait modifier l’intégration et la plasticité synaptique.
Origine : Version validée par le jury (STAR)